Die genomischen Sequenzen der meisten Viren sind bekannt.Nukleinsäuresonden , bei denen es sich um kurze DNA - Segmente handelt , die dazu bestimmt sind , mit komplementären viralen DNA - oder RNA - Segmenten zu hybridisieren .Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine effizientere Technik zum Virusnachweis.Hochdurchsatz-Diagnoseverfahren wurden kürzlich entwickelt.
A. Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik
Die Nukleinsäure-Hybridisierung, die hauptsächlich Southern Blotting (Southern) und Northern Blotting (Northern) umfasst, ist eine sich schnell entwickelnde neue Technik auf dem Gebiet der Virusdiagnostik.Der Grundgedanke des Hybridisierungsassays ist die Verwendung kurzer DNA-Segmente (als „Sonde“ bezeichnet), die für die Hybridisierung mit komplementären viralen DNA- oder RNA-Segmenten entwickelt wurden.Durch Erhitzen oder alkalische Behandlung wird doppelsträngige Ziel-DNA oder -RNA in Einzelstränge getrennt und dann auf einem festen Träger immobilisiert.Danach wird die Sonde hinzugefügt und mit der Ziel-DNA oder -RNA hybridisiert.Da die Sonde mit einem Isotop oder nicht-radioaktiven Nuklid markiert ist, kann die Ziel-DNA oder -RNA durch Autoradiographie oder durch das Biotin-Avidin-System nachgewiesen werden.Da die meisten viralen Genome geklont und sequenziert wurden, können sie mit virusspezifischen Sequenzen als Sonden in der Probe nachgewiesen werden.Derzeit umfassen die Hybridisierungsverfahren: Dot-Blot, In-situ-Hybridisierung in Zellen, DNA-Blotting (DNA) (Southern Blot) und RNA-Blotting (RNA) (Northern Blot).
B.PCR-Technologie
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von In-vitro-Nukleinsäureamplifikationstechniken entwickelt, die auf PCR basieren, um unempfindliche oder nicht kultivierbare Viren zu testen.PCR ist ein Verfahren, das spezifische DNA-Sequenzen durch in vitro-Polymerasereaktion synthetisieren kann.Der Prozess der PCR umfasst einen thermischen Zyklus aus drei Schritten: Denaturierung, Annealing und Verlängerung. Bei hoher Temperatur (93℃~95℃) wird die doppelsträngige DNA in zwei einzelne DNA-Stränge getrennt;dann lagern sich bei niedriger Temperatur (37℃~60℃) zwei synthetisierte Nukleotidprimer an die komplementären DNA-Segmente an;wohingegen bei der geeigneten Temperatur für das Taq-Enzym (72℃) die Synthese neuer DNA-Ketten am 3'-Ende des Primers beginnt, wobei komplementäre DNA als Matrizen und einzelne Nukleotide als Materialien verwendet werden.So kann nach jedem Zyklus eine DNA-Kette in zwei Ketten amplifiziert werden.Durch Wiederholen dieses Vorgangs kann jede in einem Zyklus synthetisierte DNA-Kette im nächsten Zyklus als Matrize verwendet werden, und die Anzahl der DNA-Ketten wird in jedem Zyklus verdoppelt, was bedeutet, dass die Produktion von PCR mit einer Geschwindigkeit von 2n log amplifiziert wird.Nach 25 bis 30 Zyklen wird die Produktion von PCR durch Elektrophorese identifiziert, und die spezifischen DNA-Produkte können unter UV-Licht (254 nm) beobachtet werden.Wegen ihres Vorteils der Spezifität, Sensitivität und Bequemlichkeit wurde die PCR in der klinischen Diagnose vieler Virusinfektionen wie HCV, HIV, CMV und HPV eingesetzt.Da die PCR sehr empfindlich ist und Virus-DNA auf fg-Ebene nachweisen kann, sollte die Operation sehr sorgfältig durchgeführt werden, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden.Darüber hinaus bedeutet ein positives Ergebnis im Nukleinsäuretest nicht, dass sich in der Probe ein lebender infektiöser Virus befindet.
Mit der breiten Anwendung der PCR-Technik werden neue Techniken und Methoden basierend auf der PCR-Technik für verschiedene Testzwecke entwickelt.Beispielsweise kann die quantitative Echtzeit-PCR die Viruslast erkennen;In-situ-PCR wird verwendet, um eine Virusinfektion in Gewebe oder Zellen zu identifizieren;Die verschachtelte PCR kann die Spezifität der PCR erhöhen.Unter ihnen wurde die quantitative Echtzeit-PCR schneller entwickelt.Viele neue Techniken, wie die TaqMan-Hydrolysesonde, die Hybridisierungssonde und die Molecular Beacon-Sonde, wurden zu einer quantitativen Echtzeit-PCR-Technik kombiniert, die in der klinischen Forschung weit verbreitet ist.Neben der genauen Identifizierung der Viruslast in der Körperflüssigkeit des Patienten kann diese Methode auch zum Nachweis von arzneimitteltoleranten Mutanten verwendet werden.Daher wird die quantitative Echtzeit-PCR hauptsächlich zur Bewertung der Heilwirkung und zur Überwachung der Arzneimittelverträglichkeit eingesetzt.
C. Hochdurchsatz-Nachweis viraler Nukleinsäuren
Um den Bedarf an schneller Diagnose neu auftretender Infektionskrankheiten zu decken, wurden verschiedene Hochdurchsatz-Nachweisverfahren wie DNA-Chips (DNA) etabliert.Für DNA-Chips werden spezifische Sonden synthetisiert und in sehr hoher Dichte an kleinen Siliziumchips angebracht, um DNA-Sonden-Mikroarrays (DNA) zu bilden, die mit Proben hybridisiert werden können.Das Signal der Hybridisierung kann mit einem konfokalen Mikroskop oder Laserscanner abgebildet und vom Computer weiterverarbeitet werden, und es kann ein riesiger Datensatz zu verschiedenen Genen erhalten werden.Es gibt zwei Arten von DNA-Chips.Der „Synthese-Chip“ sieht folgendermaßen aus: Die spezifischen Oligonukleotide werden direkt auf den Chips synthetisiert.Ein weiterer ist der DNA-Pool-Chip.Die geklonten Gene oder PCR-Produkte werden geordnet auf den Objektträger gedruckt.Der Vorteil der DNA-Chip-Technologie ist der gleichzeitige Nachweis einer großen Menge an DNA-Sequenzen.Die neueste Version des Erregererkennungschips kann über 1700 menschliche Viren gleichzeitig identifizieren.Die DNA-Chip-Technologie löste die Probleme herkömmlicher Nukleinsäure-Hybridisierungsmethoden und hat sehr breite Anwendungen in der Virusdiagnose und epidemiologischen Studien.
Postzeit: 23. Dezember 2020